Brett serija – 3. družbene študije

UVOD

V prvih dveh delih serije sva pokrila splošne značilnosti in funk. Ker sva oba izobražena v mikrobioloških veščinah, sva se odločila, da malenkost bolj predstaviva izbrane mikrobiološke značilnosti Brett. Med te sodijo njihov izgled, njihovo življenjsko okolje, prilagoditev na ideologijo pivskega in vinskega okolja ter družbene interakcije z drugimi, nam relevantnimi, mikroorganizmi (govorimo o čudovitih pripetljajih, ko se Brette srečajo s klasičnimi pivskimi kvasovkami in skupaj ustvarjajo nevarne steklene bombe za nič hudega sluteče pivovarje – a dovolj politike za začetek).

Skratka, mikrobiologija Brett.

EKOLOGIJA

Ekologija, ali po domače, kje živijo. Zakaj za vraga nas to zanima, če varimo pivo?! Spoznali bomo, da so, tako kot mi, produkt družbenih sil. Torej, od kje prihajaš in kje si živel, te definira, kako se boš obnašal, ko bo čas, da sfermentiraš pivo. Zato je koristno vedeti, kje najdemo naše kvasovke, če želimo z njimi sodelovati in ostati v dobrih odnosih.

Alkoholna fermentacija

Brette imajo zelo rade okolja, kjer poteka alkoholna fermentacija. Najdemo jih v pivu, vinu, pogosto so del mikroflore, ki sodeluje pri fermentacijah cidra, kombuče, kefirja in bioetanola. Prvo mesto, kjer jih lahko iščemo, je sam medij (pivina, pivo), kjer poteka alkoholna fermentacija oz. na opremi in v prostorih, ki so v stiku z alkoholnimi zvarki. To so na primer vinske kleti in leseni sodi (te Brettam še posebej odgovarjajo – našli so jih tudi do 8 cm globoko v lesu, krvoločne beštije).

breta slika 4

Slika 1: Sod s  kvasovko Brettanomyces bruxellensis ali krajše brux. (Vir: stlhops.com)

Sadje

Na splošno imajo kvasovke, ki so primerne za fermentacije piva oz. vina, zelo rade različna okolja, kjer je na voljo veliko preprostih sladkorjev (dobršen del vinskih kvasovk najdemo na grozdju). Tako bi lahko sklepali, da je Brette precej preprosto izolirati iz različnega sadja (povaljaš naključen sadež po agarni plošči za rast mikroorganizmov in na njem bo zrastlo nekaj Brett). Ampak tukaj nas Brette rade postavijo pod klasično eksistenčno vprašanje, zakaj bi bilo življenje preprosto, če se ga lahko zaplete.

Izkazalo se je, da, čeprav so Brette prisotne na sadju, ne bodo kar tako zrasle, če se bo sadje valjalo po plošči. Brette so namreč na sadju pogosto v neaktivnem stanju in se zbudijo šele, ko alkoholna fermentacija že poteka [1, 2]. To seveda ni tak problem, če je tvoj glavni cilj kompleksna spontana fermentacija z mnogo različnimi mikroorganizmi poleg Brett, ki traja prekleto dolgo in ima ogromen potencial (tako v dobrem kot tudi v slabem). V tem primeru dodatek sadja ni tako slaba ideja. Za 100% Brett piva pa se je potrebno nekoliko bolj potruditi.

breta slika 5

Slika 2: Kvasovke obožujejo rahlo nagnito sadje. Prisotnost vinskih mušic je znak, da poteka alkoholna fermentacija in je sadje potencialen vir prebujenih Brett. (Vir: yeastgenome.org)

Različni tipi Brett

Še vedno nisva odgovorila na vprašanje, zakaj je pomembno vedeti več o okolju, iz katerega Brette prihajajo, kjer so odraščale in se naučile vseh moralnih in etičnih načel. To je najlažje ponazoriti na primeru bolj znane kvasovke S. cerevisiae. Vinski sevi kvasovk S. cerevisiae bodo redko, če sploh, sposobni dokončati fermentacijo piva in obratno. Namreč, kvasovke iz obeh vrst alkoholnih eliksirjev so prilagojene/vzgojene/selekcionirane, da kar najbolje delujejo v vinskem oz. pivskem okolju. Grozdni mošt je v glavnem sestavljen iz glukoze in fruktoze, medtem ko ima pivina bolj malo glukoze in veliko maltoze. Tako se vinski sevi S. cerevisiae pogosto zelo slabo znajdejo v veliki količini maltoze in posledično ne dokončajo fermentacije.

Popolnoma enaka filozofija velja pri Brettah – tiste iz vinskega in sadnega okolja (večina sadja prav tako vsebuje v glavnem glukozo in fruktozo; vino je iz grozdja, doh) ne bodo sposobne same dokončati fermentacije piva brez pomoči kakšne druge kvasovke. Potem so tu še razlike v hitrosti rasti in konzumacije sladkorjev. Brette iz sadnega okolja so navajene, da počakajo, da se fermentacija s S. cerevisiae zaključi in šele potem pospravijo ostanke in prinesejo nekaj svojega funka.

OK, trenutno smo pri dveh različnih tipih Brett – vinskih in pivskih. Po načelu vseživljenjskega kompliciranja, vas morava razveseliti in zadevo še dodatno zaplesti. Brette iz piva bi lahko razdelili še na dva dela – Brette namenjene za 100% Brett piva in Brette, ki jih običajno najdemo v izredno kompleksnih fermentacijah, kot so lambiki in piva, ki se dokončajo z Brettam v flašah. Prve hitro zaključijo fermentacijo, medtem ko je okolje, v katerem fermentirajo lambik piva in zorijo steklenice, zelo podobno razmeram, v katerih nastaja vino. Posledično imajo take Brette več skupnega z vinskimi Brettami kot pa s pivskimi. Obstaja še vmesna kategorija, ki je sposobna delati v kateremkoli izmed naštetih okolij, vendar v nobenem ne bo posebej hitra.

Kako nam lahko te informacije koristijo?

Ali nam lahko prav pridejo tudi Brette iz vina in kako jih lahko uporabimo? En od scenarijev je dodatek vinskih Brett za zorenje piva v steklenicah. Standardni dodatek namiznega sladkorja (sestavljen je ravno iz glukoze in saharoze) je tisto, kar rabijo, da začnejo z razvijanjem funka (in seveda še karbonirajo pivo). Iz izkušenj lahko poveva, da bodo vinske Brette običajno dale več konjskega karakterja kot tiste, ki so bile izolirane iz piva. Po drugi strani pa bodo pivske proizvedle več sadnih estrov.

Podobna filozofija je tudi z dodajanjem S. cerevisiae kvasovk pri flaširanju piva. Veliko komercialnih pivovarjev, ki se ukvarja z divjimi pivi, dodajajo S. cerevisiae kvasovke za razvoj karbonacije. Te so običajno vinskega/šampanjskega izvora in se uporabljajo ravno zato, ker ne morejo pojesti preostale maltoze in imajo malo učinka na končno aromo.

MORFOLOGIJA

Kako vemo oz. vsaj sumimo (brez modernih molekularnih tehnik identifikacije), da imamo opravka z Brettami? Preprosto, pogledamo, kakšne so njihove kolonije na agarnih ploščah in kako izgledajo pod mikroskopom. Žal za to potrebujemo vsaj nek osnovni približek mikrobiološkega laboratorija. V osnovno opremo takega laboratorija sodijo avtoklav/ekonom lonec za pripravo sterilnih agarnih plošč (služijo kot gojišče za kvasovke), nekaj, s čimer lahko vzdržujemo sterilno okolje (gorilnik), in mikroskop. Če tega nimate in se ne morete igrati z izoliranjem kvasovk, vam še vedno ostanejo komercialni pripravki. V Sloveniji se dobi na primer Wyeast, ki ponuja nekaj Brettanomyces izolatov. Običajno sodijo v pivski tip, ki je primeren tako za 100% Brett fermentacijo, kot tudi za dokončanje piva v steklenicah in kombiniranje z drugimi mikroorganizmi (a žal niso najbolj zanimive po karakterju, ki ga sproducirajo).

Prva nadležna lastnost, ko hočemo definirati neka splošna pravila glede videza, je prekleto visoka variabilnost med različnimi sevi Brett. Če opazujemo kolonije na agarnih ploščah, se te lahko na grobo razdeli v tri skupine, male bele kolonije, velike bele kolonije in nagubane/hifaste. Tudi pod mikroskopom je kar nekaj razlik znotraj Brett, ampak večini je skupna limonasta/čolničasta oblika. Ta je potem lahko bolj ali manj podolgovata ali pa preide celo v psevdohife ali prave hife (ampak te so zelo redke – v zbirki imava samo eno tako, packa se zažre s svojimi hifami v vse živo in se je ne znebiš).

breta slika 6.jpg

Slika 3: Pisan svet kolonij Brett na trdem agarnem gojišču. Nagubane, gladke, velike, male … (Vir: brettanomycesproject.com in lastna zaloga)

Najpogostejši problem oz. želja jih je ločiti od klasične pivske kvasovke S. cerevisiae. Na katere iztočnice se lahko zanesemo? Žal jih ni veliko. Obe skupini se razmnožujeta s tvorbo malih brstov, kar se da lepo videti pod mikroskopom in je indikacija, da nimamo opravka s cepljivkami (Schizosaccharomyces pombe). Brette so pod mikroskopom opazno manjše in redko lepo okrogle, kot je to značilno za S. cerevisiae. Poleg tega imajo veliko bolj funky oblike kolonij (različnih barv, nagubane, velike bele …) na agarnih ploščah v primerjavi s klasično pivsko kvasovko, ki ima običajno srednje velike, gladke, okrogle bele kolonije. Še ena zanimiva lastnost Brett je, da ob rasti na agarnih ploščah tvorijo aromo po plesnivih/staranih sirih – tega kvasovke S. cerevisiae zagotovo ne počnejo. Obstaja še nekaj drugih metod, kako ločiti Brette od ostalih kvasovk. Ena od teh je uporaba selektivnih gojišč na katerih zrastejo zgolj Brette. Obstaja več različnih (WLN, WL, Brettanomyces Agar base, …). Vsem selektivnim gojiščem je skupen dodatek cikloheksamida, ki zavira sintezo proteinov v večini evkariontov, a ne v Brettah [3].

 breta slika 7

Slika 4: Pod mikroskopom vidimo na levi sliki značilno čolničasto obliko Brett in na desni lepo okroglo obliko pivske S. cerevisiae. (Vir: lastna zaloga)

Domači kvasni laboratorij:

Nujna oprema: gorilnik/vir odprtega ognja, ekonom lonec, steklovina (steklene petrijevke, viale oz. epruvete z navojem, ki se jih lahko prekuha), cepilna zanka, mikrovalovna pečica in razne posode; mikroskop ni obvezen.

Material: DME, agar, etanol, destilirana voda, …

Potrebno je osvojiti osnovne tehnike aseptičnega dela in veliko improvizirati.

Koristen kanal, kako se doma lotiti kvasnega laboratorija za izolacijo, shranjevanje in namnoževanje kvasovk ima gospod iz Sui Generis Brewing. Na njem predstavi tudi določene prakse aseptičnega dela, ki so nujno potrebne za normalno delo.

Hm, mogoče ne bi bila slaba ideja se za naslednjo serijo objav posvetiti DIY kvasnemu laboratoriju.

 

INTERAKCIJE

Tako kot v človeškem svetu, se resnična zabava začne šele, ko nas je več na kupu. Bolj kot smo si različni, bolj je divje in politično nekorektno. Enako velja tudi za mešane fermentacije z različnimi vrstami/sevi mikroorganizmov. Tukaj se ponuja nešteto možnosti, od fermentacije z različnimi sevi Brett hkrati, do kombinacij z drugimi vrstami kvasovk in bakterij. Vsem tem interakcijam je skupno, da je končni rezultat pogosto več kot samo seštevek posameznih sestavnih delov.

V primeru, ko v isto fermentacijo dodamo različne seve ali celo vrste, pride do nestrpnosti in boja za obstanek, kar v praksi pomeni, da bodo vse prisotne vrste proizvedle še več aromatičnih komponent, kar bo pomenilo še več interakcij in napetosti, katerih končni rezultat je lahko še posebej okusno opustošenje vseh sestavin in hranilnih snovi v pivini.

Na tem mestu je vredno opozoriti, da niso vse kvasovke združljive. Nekateri sevi so sposobni tvorbe toksinov, imenovanih zimocini, ki bodo uničili ali kvasovke, ki so jim zelo podobne (druge seve) [4], ali pa kvasovke drugih vrst [5], v nekaterih primerih pa se za smrtonosne lahko izkažejo tudi fizični stiki med različnimi vrstami kvasovk – ampak brez skrbi, zimocini so nevarni samo za druge kvasovke, so kot neko biološko orožje, ki prizadene samo specifično populacijo kvasovk.

Preden nadaljujemo, bova povedala samo še par stvari o interakcijah med mikroorganizmi na splošno. Najprej je potrebno omeniti, da gre za zelo zanimivo in hkrati zapleteno področje, pri katerem je še vedno veliko več vprašanj, kot pa imamo odgovorov. V grobem se te interakcije delijo na negativne (primer zimocinov iz prejšnjega odstavka) in pozitivne. Primera pozitivnih interakcij sta simbioza oz. sožitje (oba organizma imata korist od interakcij); kadar pa ima od tega korist samo eden izmed organizmov, hkrati pa to drugemu ne povzroča pretirane škode, govorimo o komensalizmu.

Pri Brettah se do sedaj ve nekaj več le o interakcijah s kvasovko S. cerevisiae, mlečnokislinskimi in ocetnokislinskimi bakterijami.

breta slika 8

Slika 5: Svetovne mojstrovine, kjer sodelujejo tudi Brette. Pri Orvalu poteka Brett fermentacija šele v steklenicah, ko S. cerevisiae že pohrusta večino sladkorjev, pri Wild wild Brett gre za 100% Brett fermentacijo, pivovarna Cantillon pa je standard dolgotrajnih mešanih fermentacij (Vir: beerandbrewing.com)

S. cerevisiae

Domačim pivovarjem je relativno dobro poznan fenomen steklenih bomb. Ko pivo naredimo s S. cerevisiae, povre do predvidene končne gravitacije. Enako se zgodi (če imamo srečo), ko pivo naredimo samo z Brettami. Povre do predvidene gravitacije in vse je v redu. Zaplete pa se, ko hočemo pivo fermentirati v prisotnosti obeh kvasovk. V tem primeru običajno dobimo precej nižjo končno gravitacijo, kot jo predvidevajo raznorazni programi in naše klasično pivovarsko znanje (govorimo o številkah blizu ali celo pod 1.000). Približevanje 0 traja precej dlje časa in hitro nas lahko zavede, da se je stvar že zaključila in je varno pospraviti pivo v steklenice. Tragedija je tako neizogibna, če se to približevanje 0 zgodi v steklenici. Sploh pa postane dramatično, če smo ob flaširanju dodali še sladkor. V najboljšem primeru bomo ob odpiranju dobili magične izlive spenjenega piva, drugače pa spontane steklene bombe in odprte flaše.

Mit #5. Pivo iz mešane fermentacije bo vedno preveč karbonirano 😦

Brez skrbi, ne bo. Je pa potrebno biti nekoliko bolj previden in potrpežljiv pri odločitvi, da se je fermentacija zaključila. Varnostna meja, ko imamo opravka z Brettami, je nekje 3 tedne. V tem času se ne sme dogajati nič več, vrelna veha mora biti pri miru in gravitacija konstantna. Potem ste varni za flaširanje in količino sladkorja se računa kot običajno. Še malo več previdnosti je potrebno, ko se odločimo, da bomo Brette uporabili samo v flašah. Takrat je težko predvideti, koliko sladkorja bodo še porabile. V tem primeru je bolj varno dodati, ali polovično dozo, ali pa še bolje, flaširati brez dodatnega sladkorja. Lahko pa se doda Brette šele, ko S. cerevisiae že opravi svoje in pride pivo do končne gravitacije. Po dodatku se opazuje, kaj se dogaja z gravitacijo v naslednjih tednih, mesecih. Ko je stvar stabilna, se flašira po ustaljeni praksi.

Nekoliko manj znano dejstvo je, da lahko s kombiniranjem nekaterih sevov kvasovk S. cerevisiae in Brett dosežemo bolj intenzivne hlevske, dimaste in ostale arome funka. Za trenutek prosim poglejmo prejšnjo objavo, poglavje o hlapnih fenolih. Kot vidite, je nastanek hlapnih fenolov odvisen od pretvorb hidroksicimetnih kislin v vinilfenole, ti pa se potem pretvorijo v etilfenole (funk.). V žitih je prisotno kar precej ferulne kisline, ki jih weizen in belgijske kvasovke pretvorijo v 4-vinilgvajakol (aromo po klinčkih in popru). To lahko naredijo tudi Brette ampak v precej manjši meri. So pa Brette odlične, ko je potrebna pretvorba 4-vinilgvajakola v 4-etilgvajakol (pravi Brett funk). Z dodatkom sadja v fermentacije bomo funk v pivu usmerili bolj v hlevske note, saj sadje vsebuje kumarno kislino, ki se preko pretvorb spremeni v 4-etilfenol, ki ima aromo po konjskem švicu.

Preden zaključimo povest o tej krvavi borbi za prevlado med Brettami in S. cerevisiae, samo še en podatek. Celična stena kvasovke S. cerevisiae ima zelo dobre adsorpcijske sposobnosti. To pomeni, da se bodo na njeno celično stene vezale različne komponente (tudi arome), ki jih bomo pri pretakanju piva skupaj s kvasovkami zavrgli. V primeru, da bi želeli dobiti maksimalen izkoristek Brett funka, bi bilo potrebno pivo najprej fermentirati s S. cerevisiae, počakati, da se kvas posede, vse skupaj pretočiti, in šele nato dodati Brette za sekundarno fermentacijo. Je pa res, da bi bili v tem primeru prikrajšani za marsikako drugo aromo, ki bi nastala med pretepom obeh kvasovk. S kombiniranjem pravih kvasovk, sestavin in postopka imamo tako vsaj delni nadzor, koliko in kakšen funk bo na koncu prisoten v našem pivu.

Bakterije

Še par besed o interakcijah z mlečnokislinskimi in ocetnokislinskimi bakterijami ter Brettami. Znano je, da Brettam povsem odgovarja kislo okolje; raziskave so pokazale, da se Brette in mlečnokislinske bakterije v bioetanolnih fermentacijah razumejo odlično [6], hkrati pa pri fermentaciji kombuče, kjer Brette sodelujejo z ocetnokislinskimi bakterijami, nastane še več aromatskih in za zdravje pozitivnih snovi, kot v primerljivih fermentacijah z drugačno sestavo mikroorganizmov [7]. To so odlične novice za vse ljubitelje kislih piv, saj to pomeni, da zaradi večjih koncentracij mlečne/ocetne kisline med mešano fermentacijo ne bomo dobili samo več acetatnih/laktatnih estrov, ampak tudi še marsikaj drugega, kar nam bo dodatno zabelilo pivo.

breta slika 9

Slika 6: Bakterija Lactobacillus casei je običajno glavni krivec za jogurt in skisano mleko. Ima pa svoje mesto tudi med kislimi pivi in se odlično razume z Brettami. (Vir: buffalobeerbiochemist.com)

 

Toliko o ekologiji, morfologiji in interakcijah. V naslednjem delu serije bova predstavila najino delo/eksperiment z Brettami in rezultate, ki sva jih pridobila. Če vas zanimajo splošni nasveti za delo z njimi, se nama pridružite naslednji mesec.

 


Miha Tome in Luka Kranjc

 

Viri:

[1] Oelofse A., Pretorius I.S. 2008. Significance of Brettanomyces and Dekkera during winemaking: A synoptic review. South African Journal of Enology and Viticulture, 29, 2: 128–144

[2] Steensels J., Daenen L., Malcorps P., Derdelinckx G., Verachtert H., Verstrepen K.J. 2015. Brettanomyces yeasts — From spoilage organisms to valuable contributors to industrial fermentations. International Journal of Food Microbiology, 206: 24–38

[3] Barnett, J.A., Payne, R.W. and Yarrow, D. (2000) Yeasts: Characteristics and Identification. Cambridge: Cambridge University Press.

[4] Maule A.P., Thomas P.D. 1973. Strains of Yeast Lethal to Brewery Yeasts. Journal of the Institute of Brewing, 79: 137–141

[5] Villalba M.L., Susana Sáez J., del Monaco S., Lopes C.A., Sangorrín M.P. 2016. TdKT, a new killer toxin produced by Torulaspora delbrueckii effective against wine spoilage yeasts. International Journal of Food Microbiology, 217: 94–100

[6] Passoth V., Blomqvist J., Schnürer J. 2007. Dekkera bruxellensis and Lactobacillus vini form a stable ethanol-producing consortium in a commercial alcohol production process. Appl. Environ. Microbiol., 73: 4354–4356

[7] Nguyen N.K., Nguyen P.B., Nguyen H.T., Le P.H. 2015. Screening the optimal ratio of symbiosis between isolated yeast and acetic acid bacteria strain from traditional kombucha for high-level production of glucuronic acid. LWT – Food Science and Technology, 64: 1149–1155

Advertisements

2 thoughts on “Brett serija – 3. družbene študije

Oddajte komentar

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

Komentirate prijavljeni s svojim WordPress.com računom. Odjava / Spremeni )

Twitter picture

Komentirate prijavljeni s svojim Twitter računom. Odjava / Spremeni )

Facebook photo

Komentirate prijavljeni s svojim Facebook računom. Odjava / Spremeni )

Google+ photo

Komentirate prijavljeni s svojim Google+ računom. Odjava / Spremeni )

Connecting to %s