Brett serija – 2. Metabolizem, konji in funk

UVOD

Zadnjič sva na splošno razpravljala o Brettah, povedala nekaj o taksonomiji in pogledala prva dva mita. Veva, da je bila taksonomija zelo zabavna in jo želite še več, zato sva danes pripravila še bolj podroben, natančen in razburljiv pogled v to področje. Začnimo s filogenetskim drevesom (način prikaza sorodnosti med različnimi vrstami).

breta tabela 1

Slika 1: Filogenetski drevesi, ki sva jih pripravila s primerjavo zaporedij ribosomske RNA (s pomočjo orodja Phylogeny [1, 2] in zbirke zaporedij RNAcentral [3]): a) primerjava med nekaterimi sesalci; b) primerjava med bolj znanimi kvasovkami.

Brez skrbi, vse, kar je potrebno videti na tej sliki, je označeno z rdečo in pove, da se kvasovke Brettanomyces in klasične pivske kvasovke Saccharomyces med seboj razlikujejo približno toliko, kot se razlikujemo ljudje (Homo sapiens) in konji (Equus caballus).

In prav tako kot ni modro sosedove mame zamenjati za kobilo, tudi ni pametno zanemariti razlik med kvasovkami, s katerimi delamo. Vprašali se boste, kako je to mogoče, saj so kvasovke samo plavajoče kroglice, ki prdijo etanol, medtem ko konji v primerjavi s človekom jedo travo, so precej bolj kosmati in imajo kopita (vem, da zanemarjam kosmatost in prehranjevalne navade nekaterih predstavnikov človeške vrste, ampak osredotočimo se na povprečni primerek).

Če želimo gledati z zornega kota mikroorganizmov, smo ljudje in konji za njih samo ogromne, hodeče, ogrevane hiše, ki spuščajo dušik in ogljikov dioksid. Razlike so v podrobnostih. S konji smo si vizualno precej različni, metabolizem pa imamo relativno podoben. No, tukaj je trik, mikroorganizmi so med seboj zaradi svoje preprostosti vizualno relativno podobni, a njihov metabolizem skriva polno malih skrivnosti in razlik – kakšne encime proizvajajo, katere reči lahko jedo, kakšne reči nastajajo pri njihovi prebavi in tako naprej.

V besedi metabolizem so zajeti vsi procesi, ki se dogajajo, da lahko celica/organizem preživi. Kvasovke lahko to počnejo s porabo kisika, tako kot mi in konji, preko Krebsovega cikla in dihalne verige na mitohondrijih. Lahko pa to počnejo z malenkost preprostejšo fermentacijo, kjer sicer ne dobijo veliko energije, ampak za to ne rabijo kisika, za bonus pa še kakajo etanol (in zastrupljajo okolico, da pobijejo konkurenco).

Etanol je pomemben pri pivu, pomemben je tudi ogljikov dioksid, ki nastaja, a najbolj zanimivi in tudi zelo pomembni so stranski produkti, ki dodajo značilne profile arome (Funk!). Te so lahko del primarnega ali pa sekundarnega metabolizma. To poglavje je tako namenjeno spoznavanju metabolizma Brett kvasovk. Predvsem bova izpostavila posebnosti oz. razlike s klasično pivsko kvasovko.

POJASNILA

Primarni metabolizem – procesi v celici, ki so absolutni nujni za preživetje celic.

Sekundarni metabolizem – vsi ostali procesi v celici, ki niso absolutno nujni za preživetje celic.

Encimi – proteini, ki sprožijo in pomagajo pri kompleksnih reakcijah.

Dekstrini – preprosti sladkorji, sestavljeni običajno iz več enot glukoze.

Prekurzorji – kemične spojine, ki so predhodniki oz. iz katerih nastajajo nove spojine v metabolnih poteh.

Za konec uvoda še nasvet, kako se lotiti tega poglavja. Ne izgubljajte se preveč v kupu informacij, ki jih bova postregla. Vse, kar si je za začetek vredno zapomniti, je, da Brette znajo delati to in to in to aromo, in če vam kaj ne bo všeč, ko boste fermentirali svoje prvo Brett pivo (hote ali nehote – okužbe so vedno zabavne) oz. se pripravljali nanj, greste lahko nazaj in poiščete, kaj so potencialni vzroki za nevšečnosti in radosti.

PRIMARNI METABOLIZEM

Sladkorji:

Na začetku vam kaj novega niti ne moreva povedati, saj vsi vemo, da kvasovke naredijo alkohol s fermentacijo sladkorjev. Kvasovka S. cerevisiae je pri tem daleč najbolj učinkovita, kar je posledica večtisočletnega selekcioniranja človeštva, ki je želelo piti vsaj za silo užitne alkoholne pijače. Posledično so se udomačene kvasovke svinjsko razvadile in se odločile, da se ne bodo več trudile jesti kompleksnih sladkorjev, ker so imele na voljo več kot dovolj preprostih. Pri Brettah tega še ne moremo trditi, saj so se navadile pobirati tudi sladkorje, ki so ostali po požrtiji Saccharomyces kvasovk.

V duhu izkoriščanja sladkorjev pri fermentaciji z Brettami je vredno izpostaviti dva encima, ki močno zaznamujeta njihovo prisotnost v pivini in sta pomembna pri pripravi molekul za ustvarjanje funka.

Intracelularne in ekstracelularne (delujejo znotraj in zunaj celice) a-glukozidaze so odgovorne za rezanje do približno devet enot glukoze dolgih dekstrinov [4]. To je pomembno, saj so običajne pivske kvasovke sposobne uporabiti samo do dveh enot (disaharid maltoza, Saccharomyces cerevisiae) oz. treh enot (trisaharid maltotrioza, Saccharomyces pastorianus) dolge sladkorje. Zato so Brett piva običajno bolj suha (in po možnosti steklene bombe), saj pojedo veliko dodatnih dekstrinov, ki jih pridobimo pri pripravi pivine. Običajna sestava pivine je okoli 15% maltotrioze, 45-60% maltoze, 5% saharoze, 10% glukoze in fruktoze ter 20-30% dekstrinov in raznih saharidov kot so arabinoza, ksiloza, riboza, izomaltoza, … [5]. Brette se tako do neke mere zažrejo v teh 20-30% dekstrinov in ostalih saharidov. Večjo suhost Brett piv se poudari še z nekoliko nižjo produkcijo glicerola v primerjavi s pivskimi kvasovkami.

Poleg a-glukozidaz imajo nekatere Brette dodatno moč še z b-glukozidazam. To so encimi, ki so sposobni hidrolizirati (razrezati) različne sladkorje, med drugim laktozo, celobiozo in glikozide, ki so prisotni v različnih hmeljih, sadju in začimbah. Posledica tega je, da znajo Brette spremeniti profile obstoječih okusov v nekaj povsem drugega, bolj funky [6]. In ker sva ravno omenila celobiozo – ta sladkor je prisoten v lesu. Velika večina sodov je z notranje strani ožgana in to ožiganje sodov naredi celobiozo dostopno Brettam, ki jo lahko nato koristijo kot dodatni prigrizek.

breta slika 1

Slika 2: Malo pornografije za spočiti oči (in vznemirjenje ostalih čutil). Mojstrovina izpod rok Cantillon pivovarne, čudovite kisle marelice z mehkim žametom Brett funka (Vir slike: [17]).

Kisik:

Naslednja stvar, ki jo Brette potrebujejo, da lahko naredijo kolikor toliko spodobno pivo, je kisik, in sicer v malenkost večjih količinah (10–12 ppm [7]) kot ga potrebuje S. cerevisiae. Seveda za to obstaja dovolj dobra razlaga. Brette so svojo sposobnost pridelave alkohola razvile neodvisno od kvasovke S. cerevisiae [8] in njihov način pridelave alkohola zahteva vsaj minimalno prisotnost kisika (v znanstveni literaturi se to omenja kot Custerjev efekt, prvič pa je bil opisan ravno pri Brettah).

Zakaj bi to lahko bil pomemben podatek za domačega pivovarja? Eden od možnih razlogov, zakaj se 100% Brett fermentacija ne zaključi na predvideni končni gostoti, bi lahko bilo prav izčrpanje zalog kisika raztopljenega v pivini. Po drugi strani ta sla po kisiku (v kombinaciji z že prej omenjenim encimom b-glukozidazo) naredi Brette zanimive za močno hmeljena piva – skoraj popolna odsotnost kisika prepreči oksidacijo aromatičnih komponent hmelja in samega piva!

In ker smo ravno pri kisiku, je čas da pridemo do naslednjega mita:

Mit #3. Odgovorne so za zakisanje piva.

Da, ampak ne čisto zares. Brette lahko tvorijo ocetno kislino, vendar mora biti zato prisoten kisik. Ta lahko pride v fermentor v zadostnih količinah samo pri fermentacijah v odprtih posodah, ali pa v dolgotrajnih fermentacijah v lesenih sodih. Resda Brette v povprečju naredijo nekoliko več ocetne kisline kot S. cerevisiae (ja, tudi pivska kvasovka dela ocetno) ampak jo večino potem tudi porabijo za tvorbo estrov (zato so piva z Brettami tudi bolj sadna!). Večino zakisanja običajno opravijo mlečnokislinske bakterije.

SEKUNDARNI METABOLIZEM (FUNK)

Primarni metabolizem je pokrit, sedaj pa si poglejmo še pestro dogajanje v sekundarnem metabolizmu. Veliko sekundarnih metabolitov značilno zaznamuje profil piva, ki ga dobimo pri fermentaciji z Brettami in ga lahko z eno besedo poimenujemo kot funk. Za začetek poglejmo, kaj za vraga se skriva pod to besedo in kako opisati vse čudovite in malo manj čudovite reči, ki jih lahko počnejo Brette v sekundarnem metabolizmu.

Brettanomyces-Flavor-Wheel

Slika 3: Na SourBeerBlogu je »Dr. Lambic« prilepil zelo uporabno kolo Brett funka. Pri tem je dopisal, da si lahko s tem pomagamo kategorizirati učinke različnih sekundarnih metabolitov. Dodal je tudi, da gre lahko funk tudi v neprijetne profile in da nas v takem primeru ne sme biti sram tega piva zavreči [9].

Funk je torej mešanica različnih sekundarnih (in nekaj primarnih) metabolitov, ki močno vplivajo na profil okusa piva fermentiranega z Brettami. Samo nekaj besed s katerimi se lahko opiše funk: klinčki, pikanten, konji, hlev, dimljen, medicinski, kovinski, obliži, krekerji, koze, jabolčka, cvetlični, tropsko sadje in citrusi.

Sedaj si nekoliko bolj podrobno poglejmo, katere spojine pričarajo vse te radosti funka. Pri tem je vredno dodati, da prekurzorji pridejo iz surovih materialov pri proizvodnji piva (in ostalih mikroorganizmov v primeru mešanih fermentacij), zato je na primer zelo pomembno, pri kateri temperaturi opravljamo saharifikacijo. Poleg tega je treba ponovno izpostaviti, da zmožnost proizvodnje teh molekul močno variira med različnimi sevi Brett. Nekatere v najini zbirki so zelo konjske, pri drugih pa komaj opaziš, da so sploh Brette.

Hlapni fenoli:

So odgovorni za najbolj značilne arome, ki jih povezujemo z Brettami.

Ime Opis arome
4‐vinilgvajakol Klinčki
4‐etilgvajakol Pikantno, klinčki
4‐vinilfenol Fenol, plastika, dimljeno
4‐etilfenol Pikantno, dimljeno, konji
4‐vinilkatehol Plastika, dimljeno, grenko
4‐etilkatehol Obliži, medicinsko, hlev

 Preglednica 1: Hlapni fenoli (Vir: [10, 11]).

Kombinacija različnih fenolov se med seboj ojača, dopolnjuje in pričara različne profile okusov, kljub temu da so lahko posamezne komponente tudi močno pod pragom zaznave. To grozno oteži razlago, kako pridemo do posebnih arom. Za pojav konjev namesto klinčkov je dovolj že malenkost drugačno razmerje med fenoli.

Za nastajanje fenolov sta odgovorna dva encima. Prvi je dekarboksilaza za fenolno (cimetno) kislino. Ta pretvori hidroksicimetne kisline v 4-vinil derivate. Drugi pa je vinil fenol reduktaza, ki reducira 4-vinil derivate v 4-etil derivate [12]. Aktivnost drugega encima je izjemno redka in so jo znanstveniki do sedaj odkrili samo v Brettanomyces kvasovkah in parih drugih mikroorganizmih. In ravno ta encim je en izmed glavnih razlogov, zakaj so tako zelo zanimive pri ustvarjanju drugačnih arom v svetu fermentiranih pijač. Za zanimivost je potrebno povedati, da se tudi Luka raziskovalno ukvarja prav s tem encimom.

 bretta slika 2

Slika 4: Prikaz kako nastanejo značilni hlapni fenoli Brett arom iz spojin, ki jih najdemo v osnovnih sestavinah (Vir: [13]).

Estri:

Brette imajo pester nabor esteraz (encimov, ki iz kislin in alkohola proizvajajo estre in obratno). Estri tudi značilno dodajo na kompleksnosti arome in jih je zato smiselno pogledati malo bolj podrobno.

Ime Opis arome
Etil acetat Sadno, topila
Etil laktat Sadno, maslo
Etil oktaonat Kisla jabolka, vosek
Etil heksanoat Sadno, ananas, jabolčka, janeževa zvezda
Fenetil acetat Vrtnična voda

 Preglednica 2: Značilni estri v Brett fermentacijah [14]

Poleg tega naše kvasovke značilno zmanjšajo isoamil acetat (banane!) [14]. Omembe vredno je še odkritje Chada Yakobseena, da Brette pri višjih količinah mlečne kisline proizvedejo več etil laktata (veliko presenečenje) in višjih alkoholov ter nekoliko manj ostalih estrov (etil heksanoata, etil oktaonata). Rezultat vsega skupaj je bolj sadno pivo! Poleg tega naj bi Brette nekoliko bolje rastle in izkoriščale sladkorje pri nižjem pH-ju [15]. Torej, mlečna kislina + Brette = večinoma good.

Ostalo:

Brette znajo proizvajati tudi tetrahidropiridine, ki imajo okus po kreker piškotih, pri nizkem pH pa gredo te arome v kovinske ali grenke profile [16] odgovorni pa so tudi za aromo po miševini, ki jo domači pivovarji sicer bolje poznamo kot »cat-piss«, ki se pogosto napačno pripisuje komponentam hlevske arome. Njihova proizvodnja je odvisna od količine aminokislin, kisika in etanola.

Omembe vredni so še biogeni amini – ki so lahko zdravju škodljivi (histamin). Proizvajajo jih vse kvasovke, tudi naše preljube pivske kvasovke. Brette se od pivskih razlikujejo v tem, da imajo nekoliko večji odstotek 2-feniletilamina. Načeloma gre za zanemarljive količine, ki pa lahko pri bolj občutljivih ljudeh povzročijo blago alergijsko reakcijo – podobno kot nekatera rdeča vina.

Mit #4. Prekleti konji in koze (pivo gre vedno v konjske, hlevske arome)

Tukaj je spet odvisno, kako naše kvasovke uporabimo. Če delamo primarno fermentacijo izključno z Brettami, bo funka načeloma zelo malo (ni drugih mikroorganizmov, ki bi proizvajali prekurzorje in vplivali na metabolizem Brett). Pri tem je tudi pomembno, kako pripravimo našo pivino; ekstrakcija ferulične kisline na primer ojača potencial dimljenih konjev (prekurzor za hlapne fenole).

Če jo uporabimo v sekundarni fermentaciji, konji s časom postanejo vedno bolj intenzivni. Poleg tega je pri Brettah evolucija arom skozi čas vedno prisotna. S časom bo postajalo vsako Brett pivo vedno bolj funky, saj s svojo encimsko močjo počasi in vztrajno spreminjajo in požrejo veliko obstoječih spojin v pivu. Je pa količina konjev spet odvisna od posameznega seva, tako kot se na primer razlikujejo belgijske od zelo čistih ameriških pivskih kvasovk.

Pri uporabi Brett za dokončanje piva v flašah je potrebno biti nekoliko bolj pozoren, saj razpad Saccharomyces celic spusti v okolje različne metabolite (npr. trehalozo, kapronsko, kaprilno in kaprinsko kislino). Trehaloza je en od sladkorjev, ki ga imajo Brette rade, in preveč lahko povzroči prekomerno karbonirano pivo. Kapronske, kaprilne, kaprinske kisline pa se pretvorijo v estre in v nizkih količinah pričarajo čudovito tropsko sadje, a če jih je preveč, pridejo koze [13]. Težko je življenje.

V tem poglavju sva se osredotočila na posebnosti metabolizma Brett, a gotovo vas zanimajo še splošne značilnosti glede dela, fermentacije in vsega kar gre skupaj za uspešno varjenje z njimi. Več o tem boste lahko prebrali naslednji mesec v novem delu Brett serije.


Miha Tome in Luka Kranjc

Viri:

[1] Dereeper A.*, Guignon V.*, Blanc G., Audic S., Buffet S., Chevenet F., Dufayard J.F., Guindon S., Lefort V., Lescot M., Claverie J.M., Gascuel O. 2008. Phylogeny.fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Res. Jul 1;36(Web Server issue):W465-9. Epub 2008 Apr 19. (PubMed) *: joint first authors

[2] Dereeper A., Audic S., Claverie J.M., Blanc G. 2010. BLAST-EXPLORER helps you building datasets for phylogenetic analysis. BMC Evol Biol. 2010 Jan 12;10:8. (PubMed)

[3] The RNAcentral Consortium. 2014. RNAcentral: an international database of ncRNA sequences. Nucl. Acids Res. (28 January 2015) 43 (D1): D123-D129.

[4] Shantha Kumara H. M. C., De Cort S., Verachtert H. 1993. Localization and characterization of the a-glucosidase activity in Brettanomyces lambicus. Applied and Environmental Microbiology, Vol.59, No.8, 2352-2358

[5] Boulton C., Quain D. 2001. Brewing Yeast and Fermentation. Blackwell Publishing Ltd. Oxford.

[6] Daenen, L., Saison, D., Sterckx, F., Delvaux, F.R., Verachtert, H., and Derdelinckx, G. 2007. Screening and evaluation of the glucoside hydrolase activity in Saccharomyces and Brettanomyces brewing yeasts. Journal of Applied Microbiology, 104, 478-488

[7] Tonsmeire, M. 2014. American Sour Beers, Innovative Techniques for mixed Fermentations. Brewers publications. United States

[8] Rozpędowska, E., Hellborg, L., Ishchuk, O.P., Orhan, F., Galafassi, S., Merico, A., Woolfit, M., Compagno, C., Piškur, J. 2011. Parallel evolution of the make–accumulate–consume strategy in Saccharomyces and Dekkera yeasts. Nat. Commun. 2, 302. doi:10.1038/ncomms1305

[9] Matt “Dr. Lambic” Miller. Designing and Brewing a Flanders Red Ale. Sourbeer Blog. Dostopno na: http://sourbeerblog.com/designing-and-brewing-a-flanders-red-ale/

[10] Heresztyn, T. 1986. Formation of substituted Tetrahydropyridines by species of Brettanomyces and isolated from mousy wines. American Journal of Enology and Viticulture, Vol. 37, No. 2, 127-132

[11] Chatonnet, P., Dubourdeiu, D., and Boidron, J.N. 1995. The Influence of Brettanomyces/Dekkera sp. yeasts and lactic acid bacteria on the ethylphenol content of red wines. American Journal of Enology and Viticulture, Vol. 46, No. 4 463-468

[12] Godoy, L., Garrido, D., Martinez, C., Saavedra, J., Combina, M., and Angelica Ganga, M. 2009. Study of the coumarate decarboxylase and vinylphenol reductase activities of Dekkera bruxellensis (anamorph Brettanomyces bruxellensis) isolates. Letter in Applied Microbiology, 48, 452-457

[13] Yakobson C., 2011. Brettanomyces in Brewing the horse the goat and the barnyard. Project Brettanomyces.

[14] Spaepen, M., Van Oevelen, D., and Verachtert, H. 1978. Fatty Acids and Esters Produced During the Spontaneous Fermentation of Lambic and Gueuze. Journal of the Institute of Brewing. Vol.84 278-282

[15] Yakobson C., 2010. Pure Culture Fermentation Characteristics of Brettanomyces Yeast Species and Their Use in the Brewing Industry. Dostopno na: http://www.brettanomycesproject.com/dissertation/ (11.12.2015)

[16] Oelofse, A., Pretorius, I.S., and du Toit, M. 2008. Significance of Brettanomyces and Dekkera during winemaking: A synoptic review. South African Journal of Enology and Viticulture, Vol. 29, No. 2, 128-144

[17] BEER CHATTER. 2015. Cantillon Fou’ Foune. Dostopno na: http://beerchatter.com/2015/03/08/ cantillon-fou-foune/ (15.12.2015)

Advertisements

One thought on “Brett serija – 2. Metabolizem, konji in funk

  1. Pingback: Brett serija – 3. družbene študije | Društvo ljubiteljev domačega pivovarstva

Oddajte komentar

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

Komentirate prijavljeni s svojim WordPress.com računom. Odjava / Spremeni )

Twitter picture

Komentirate prijavljeni s svojim Twitter računom. Odjava / Spremeni )

Facebook photo

Komentirate prijavljeni s svojim Facebook računom. Odjava / Spremeni )

Google+ photo

Komentirate prijavljeni s svojim Google+ računom. Odjava / Spremeni )

Connecting to %s